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Vorträge - Tuberkulose: Seminar Pharmakologie, SS 1998.
CD4-T-Zellen: Erkennen antigener Peptide im Zshg. mit MHC-Klasse-I
CD8-T-Zellen: " " " " MHC-Klasse II
*/*-T-Zell-Rezeptoren: > 95% der postthymischen T-Zellen in peripherenen Organen und Blut
*/*-T-Zell-Rezeptoren: v.a. in mukösen Geweben, wie Lunge
Ausschalten der CD4-T-Zellen durch spezif. monoklonale Antikörper
-> experimentelle Infektion von Mäusen mit M. tuberculosis und BCG
* Schutz gegen M.tuberculosis und BCG v.a. abhängig vom Transfer selektiver CD4-T-Zellen
* mutierte Mäuse mit Mangel an MHC-Klasse-II-Gen + ohne funktionell aktiven CD4-T-Zellen ...sterben an M. Tuberculosis und BCG
=> Essentielle Bedeutung der CD4-T-Zellen zum Schutz gegen Tuberculose
*
CD4-Verarmung infolge HIV resultiert oft in Tbc bei AIDS-Patienten
Transfer selektierter CD8-T-Zellen -> übertragener Schutz vor Tbc
Verarmung an CD8-T-Zellen mit spezif. monoklonalen Antikörpern
-> M. tuberculosis bei Mäusen *
Untermauert durch Anwendung an mutierten Mäusen, in denen das
*2-microglobulin (*2m)-Gen ausgeschaltet war
*
- notwendig für Exprimierung von MHC-Klasse-I an der Oberfläche
- *2m-mutierte Mäuse sind ohne funktionell aktive CD8-T-Zellen
- Mäuse sterben schnell an M. tuberculosis aber nicht an BCG-Infektionen.
Von gegen M. tuberculosis und BCG immunen Mäusen werden mykobakterium-spezif. CD8-T-Zellen isoliert
-> bei menschl. TBc nicht entdeckt
-> beschränkt auf MHC-Klasse-I => Wirft folgende Frage auf:
Allg. anerkannt: M. tuberculosis bleibt im Endosomalraum
* Hinweise, daß M.tuberculosis aus den Phagolysosomen ins Zytoplasma entweicht
1. Im Zytoplasma befindliche Mikroben könnten Proteine produzieren, die MHC-Klasse-I-Moleküle kontaktieren.
2. Während persistierender Replikation im Phagosomen werden mykobakteri- elle Proteine oder Peptide ins Zytoplasma freigesetzt.
-> dort treten sie mit MHC-Klasse-I-Maschinerie in Verbindung
Neuere Ergebnisse zeigen: MHC-Kl-I-Herstellung kann unabhängig von der Freisetzung der Mikroben ins Zytoplasma ablaufen.
Neben auf MHC-Klasse-I-beschränkte CD8-T-Zellen wurden auch entdeckt
-> nicht auf MHC-Klasse-I-beschränkte T-Zellen
- auf Peptide mit Sequenz für N-formylmethionin (N-fMet) gerichtet
*
- dient wahrscheinlich als Sekretionssignal in prokaryotischen Zellen
- bei Säugern nur vorhanden in von mitochondrialen Genen codierten Proteinen
- wird von ungewöhnlichen MHC-Klasse-Ib-Molekülen prasentiert
*
deren Produkte bleiben im wesentlichen unverändert + variieren nur bei wenigen Mäusestämmen
=> Teilmenge der Bakterien-spezifischen CD8-T-Zellen fokussiert auf
- bakterielle Peptide und
- nicht-polymorphe Präsentationselemente.
Bei Übertragbarkeit dieser Beobachtungen auf den Menschen:
Wichtige Folgerungen für eine Peptidimpfung gegen Bakterien mit wenigen Peptiden und unabhängig vom Polymorphismus von Antigenen gegen meschl. Lymphozyten kann anvisiert werden.
- bei Umkehrreaktionen bei Leprapatienten + bei tuberkulären Lymphadenitis- Läsionen identifiziert
- keine erhöhte */*-T-Zellzahl in Lymphknotengranulomen bei Tbc-Patienten
- Akkumulieren bei der Maus früh
- an der Stelle der BCG-Replikation
- in drainierenden Lymphknoten nach Immunisierung mit vollständigem Freund´s Adjuvans
- in der Lunge nach Aerosolimmunisierung mit mykobakteriellen Komponenten
- direkter Beweis muß noch erbracht werden mit mutierten Mäusen ohne */*-
T-Zellen; */*-T-Zellen beim Gesunden proliferieren kräftig als Antwort auf mykobakterielle Komponenten
Verbreitung von */*-T-Zellen durch Mykobakterien zum großen Maße durch
-> niederbakterielle Komponenten verursacht (wirken als Superantigen)
=>scheinen auch von M. tuberculosis-Antigenen stimuliert zu werden (Arten von Antigenen und Präsentationsmolekülen für diese Stimulierung bisher noch unbekannt; Annahme: MHC-Klasse-II-Moleküle, stimulieren CD8-T-Zellen)
In vitro-Studien zeigen: Mykobakterium-reaktive CD4-T-Zellen sind potente Interferon-*-Produzenten (IFN-*)
*
hergestellt auch von CD8-T-Zellen mit mykobakterieller Spezifität der Maus
*
- hauptsächlicher Mediator (Vermittler) der Resistenz gegen Tbc
- zeigen, wie CD4-T-Zellen, spezif. zytoloytische Aktivität, z.B. lysieren
Makrophagen, die mykobakterielle Antigene exprimieren oder mit M. tuberculosis/BCG infiziert sind (sowohl in vitro wie in vivo für Schutz von Bed.)
Neben */*-T-Zellen andere für die Abwehr wichtige Zellen:
-> Zellen mit Fähigkeit zur IFN-*-Bildung und zytolytischer Aktivität:
-> NK-Zellen, */*-T-Zellen, Polymorphonukleäre Granulozyten (PNG, prod. hochproteolytische Enzyme zur Verflüssigung von Geweben)
Reihenfolge in Bezug auf Wachstum von M.tuberculosis:
PNG, NK-Zellen, */*-T-Zellen, */*-T-Zellen
=> Hemmung des Bakterien-Wachstums durch Lyse von BCG-infizierten Makrophagen
=> Absonderung von wachstumshemmenden, toxischen Makroph.produkten
durch gezielte Zelllyse gefördert -> Hinweis für direkt-schützenden Effekt durch zytolysierende T-Zellen
* optimaler Schutz durch koordiniertes Zs.spiel des Makrophagen durch IFN-*
und gezielter Zelllyse
M. tuberculosis extrem resistent gegen Abwehr durch Makorophagen
*
kann über Jahre im Gesunden überdauern, ohne Krankheitsbild hervorzurufen
*
Immunsystem scheitert bei vollständigen Beseitigung des Pathogens und muß sich verlassen auf -> bakterielles In-Schach-Halten und Wachstumshemmung
Makrophagen vor und nach der IFN-*-Stimulation als Lebensraum abgelehnt
-> Lyse des Makrophagen = Zerstören des Lebensraumes
Verbesserung der Abwehr gegen Tbc nur dann, wenn Mikroorganismen nach Lyse von effektiveren Phagozyten aufgenommen werden
*
- Zs.spiel von Lyse und Aktivation von MP am besten in produzierenden
Granulomen kontollierbar
* Zelllyse verursacht Gewebeschäden, Störung von Organfunktionen, Förderung von mikrobieller Verbreitung in Abwesenheit von Phagozytose
* Lyse infizierter MP zweischneidiges Schwert - erreicht je nach Ausgangslage einen günstigen oder schädigenden Effekt
Charakteristika der Antigene von M. tuberculosis und BCG, die durch T-Zellen erkannt werden:
1. Intrazelluläre Lokation (Phagosom * Cytosol) diktiert Verarbeitung durch MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Weg (s.o.)
2. Intrazelluläre Vermehrungsfähigkeit des Pathogens bestimmt Verfügbarkeit von Polypeptiden zur Verarbeitung
Da lösliche Proteinantigene nicht in den MHC-Klasse-I-Weg eingeführt werden können
-> Design von Subunit-Impfstoffen erfordert Gebrauch geeignter Adjuvanzien
oder lebensfähiger Carrier, die sowohl MHC-Kl.-I wie -Kl.-II-Weg anzielen
Solange MP nicht relevante Anzahl an intrazellulären M. tuberculosis töten
-> sezernierte Proteine/metabolisch prod. Peptide hauptsächliche Antigenquelle
Sterben M. tuberculosis und M. bovis später im aktivierten MP, werden
-> körpereigene Proteine eine Hauptquelle von T-Zell-Antigenen
Zwei Aspekte zur Erklärung der niedrigen Effektivität des einzigen Impfstoffs gegen Tbc, BCG:
- Je weniger metabolisch aktiv die Bakterien, desto niedriger relativer Anteil an sezernierten Proteinantigenen.
- Schlafende Tbc-Bazillen ohne auffallende metabolische Aktivität, aber mit Widerstand gegen Abtöten durch MP = ineffektive Quelle für jedes Antigen
Bezug zum Impfstoff BCG:
1. BCG aktiviert v.a. CD4-T-Zellen (ausreichend Schutz gegen BCG, unge- nügend für effektive Impfung gegen Tbc)
Vielleicht schränkt das -> kürzere Überleben von BCG zs. mit
-> Mangel an Zytolysinen
den Zugang von BCG-abgestimmten Proteinen zum MHC-Klasse-I-Weg ein.
2. Aufgrund der kürzeren Überlebenszeit von BCG herrschen körpereigene Anti- genekurz nach der Infektion vor.
Frühes Erkennen von durch M. tuberculosis infizierten MP erfolgt durch T- Zellen, die sezernierte Proteine erkennen.
* Daher kann * Überwiegen von CD4-T-Zellen und somatischen Antigenen
wenigstens teilweise den unzureichenden Schutz einer BCG-Impfung gegen M. tuberculosis erklären.
Tbc-Eintrittspforte und Hauptbefallswege: LUNGE
*
Inhalation -> Alveolar-Makrophage, für Abtöten von Mikroben unzureichend * ausgestattet
Transport ins Lungenparenchym + in drainierende Lymphknoten,
wo Mikroben replizieren
Infizierte Makrophagen produzieren Chemokine -> führen zum Gefäßaustritt von übrigen Phagozyten (PNG und Blutmonozyten)
*
sezernieren beachtliche Mengen an proteolytischen Enzymen -> exudative Läsion
Aktivierte MP sezernieren auch TNF (Tumor-Nekrose-Faktor)
-> initiiert Bildung von Granulomen
*
In Lymphknoten aktivierte T- und NK-Zellen ziehen zum Entzündungsherd
- NK-Zellen und */*-T-Zellen schneller als */*-T-Zellen, letztere jedoch zahlenmäßig stärker
- */*- und */*-T-Zellen interagieren mit MP, die mykobakterielle Peptide im Zshg. mit adaequaten MHC-Molekülen präsentieren
MP produzieren IFN-* (wie NK-Zellen)
*
aktiviert tuberkulostatische Makrophagenfunktionen
*
produzierendes Granulom mit höherem zellulärem Umsatz entwickelt sich
*
- Bakterien und ihr Wachstum darin eingeschränkt
- hemmen bakterielle Replikation, können Pathogene nicht vollständig abtöten.
Besonders die vielzelligen Riesenzellen beherbergen M. tuberculosis, ohne den intrazellulären Feind ausschalten zu können.
* Lyse solcher Zellen erlaubt Abwehr durch ermöglichte Aufnahme durch effektivere Phagozyten.
Später: - Nekrotisieren des Zentrums -> dabei spielt TNF eine wichtige Rolle!
- Einkapselung des produzierenden Granuloms durch einen fibrotischen * Wall
- Einengung und Begrenzung der Mikroben
- niedriger O2-Partialdruck (pO2) im nekrotischen Zentrum
= ungünstige Wachstumsbedingungen für M. tuberculosis
Unkontrollierte Zellzerstörung durch zytolysierende T-, NK- Zellen, aktivierte MP und/oder PNG können fördern
- Verflüssigung des Granuloms und
- Aufbrechen ins Bronchoalveolar- und Gefäßsystem.
Der zelluläre Abfall und das gestiegene pO2 erzeugen ein exzellentes Medium für unkontrollierte Vermehrung von M. tuberculosis.
Aufbrechen der Granulome fördern die Verbreitung von Mikroben durch das bronchoalveoläre System in das Umfeld und das Blutgefäßsystem in andere Gewebe.
Wenn in vitro CD4-, CD8- und */*-T-Zellen so ähnlich sind, warum sind so viele verschiedene T-Zellen zum Schutz notwendig?
Diese Frage kann momentan nicht vollständig beantwortet werden.
Erklärungsversuche:
1. Vorteil von CD8- und */*- gegenüber CD4-T-Zellen:
- sind auf MHC-Klasse-I-Moleküle beschränkt, die auf praktisch allen Zellen exprimiert werden
- MHC-Klasse-II-Exprimierung nur auf bestimmte Zellen, wie MP, beschränkt
Obwohl M. tuberculosis v.a. auf MP sitzt, werden auch infiziert
-> wenige Parenchymzellen, typischerweise in der Lunge.
*
bleiben von CD4- unbemerkt, nur von CD8- und ev. */*-T-Zellen identifizierbar
2. Unterschiedliche Aktivationskinetik:
*/*-T-Zellen erreichen wohl als erstes den Ort bakteriellen Wachstums (s.o.)
*
leisten essentielle Effektorfunktionen vor den */*-T-Zellen
3. Unterschied hinsichtlich der Effektorfunktionen, z.B. Fähigkeit, das Gefäß- bett zu verlassen oder Reaktion auf Entzündungszeichen. Dies ist noch unklar.
4. Unterschiedliche Verteilung im Gewebe, v.a. bei */*- und */*-T-Zellen:
In mukösen Geweben (incl. Lunge): Prozentsatz an */*-T-Zellen auffällig höher als im peripheren Blut und zentralen Lymphorganen.
5. Regulatorische Interaktionen zwischen diesen T-Zell-Subunits erforderlich:
*/*-T-Zellen kontrollieren die Aktivierung der */*-T-Zellen nicht nur in vitro, sondern auch in vivo.
- Jährliche Sterberate bei Erstbeobachtung: 10% im Qu´appelle Valley Indian
Reservation in Kanada
- Jährliche Sterberate 40 Jahre später: 0,2%
=> Hinweis auf Selektion nach Resistenz des Wirts gegen Tbc
- Annahme, daß Empfänglichkeit für Tbc (wie für viele Infektionskrankheiten)
unter genetischer Kontrolle steht
*
- hoher Grad an Übereinstimmung an Tbc bei ein- und zweieiigen Zwillingen
- tragischer Vorfall in Lübeck 1927, bei dem Kinder versehentlich mit einem
lebensfähigen, virulenten M. tuberculosis-Stamm immunisiert wurden.
-> beachtliche Unterschiede bei Empfänglichkeit für Tbc: Tod bis Erholung
* spricht für genetische Basis einer Resistenz gegen mykobakter. Krankheiten
Das Klonen von cDNA für das BCG-Gen (=Nramp [natural-resistance-associated macrophage protein]) wurde kürzlich erreicht durch
- Typisierung von Resistenz und Empfänglichkeit von BCG bei rekombinanten Inzucht-Mäusestämmen zusammen mit Kopplungsanalyse und
- genauer Präparation von 30-centimorgan-Segmenten auf dem Chromosom 1 der Maus.
Sequenzanalyse der Nramp-cDNA zeigt ein
-> offenes, lesbares Fenster von 1 452 Nukleotiden
*
kodiert ein Protein von 484 AS mit strukturellen Homologen zu einem eukaryotischen Nitrattransporter.
Analyse der cDNA von 7 Bcg-r und 6 Bcg-s-Mäusestämmen zeigt:
-> BCG-Empfänglichkeit Ergebnis einer G-A-Umlagerung an Position 783,
verbunden mit einer nicht-konservativen Substitution von Asp-105 durch Gly 105 innerhalb der vorhergesagten transmembranalen Domäne von Nramp.
Vergleich zwischen AS-Sequenz von Mäuse-Nramp und menschl. Homolog zeigt
-> 89% Homologie zwischen beiden Spezies.
Nukleinsäure-Sequenzanalyse zeigt:
Gly-105 der Mäuse-Nramp ist bei menschlicher Sequenz erhalten.
Bcg-r-Gen vermittelt Resistenz gegen Mykobakterien durch
-> frühes Wirken während der nicht-immunen Phase bei Mäuseinfektionen
*
Präzise biochemische und molekulare Mechanismen über Regelung der Resistenz und Empfänglichkeit durch Nramp müssen noch definiert werden.
Experimentelle Hinweise: Nramo-Phänotyp wird durch Makrophagen vermittelt
*
- Zelltyp, der Nramp-Ph. exprimiert, entstammt Knochenmark und ist relativ
resistent gegen Radioaktivität
- phänotypische Expression von Nramp kann inaktiviert werden durch chroni- sche Exposition von Silica (MP-Gift) gegenüber Mäusen
- Nramp mRNAs werden vorzugsweise exprimiert im retikuloendothelialen Sys- tem, v.a. im MP.
Hinweise:
1. RNI ist effizient antimykobakteriell (RNI wird erzeugt durch den L-Arginin- abhängigen zytotoxischen Mechanismus des MP)
2. Auffallende strukturelle Ähnlichkeit des Nramp-Proteins mit einem eukaryo- tischen Nitrattransporter.
=> so ist es möglich, daß Nramp am L-Arginin-abhängigen antimykobakteri- ellen Weg durch NO2-Transport teilnimmt
*
Ammoniakproduktion durch M. tuberculosis als Möglichkeit, die Erzeugung toxi-scher RNI abzufangen durch Verschiebung des phagolysosomalen Inhalts ins Alkalische.
Die - Existenz menschl. Homologen von Nramp zusammen mit der
- Anwesenheit auf menschl. Chromosom 2q an einer Stelle synten zum
30-centimorgan Segment auf Chromosom 1 der Maus, das das BCG-Allel enthält,
sollte Optimismus hervorrufen, die genetische Basis für Resistenz und Empfäng-lichkeit für mykobakterielle Krankheiten, wenigstens in der frühen Infektions-phase, herauszufinden.
Es wird erhofft, daß die Aufklärung eines Aspekts dieser schwierigen Frage als Sprungbrett zum Verständnis bisher unbekannter genetischer Faktoen dienen kann (wie z.B. die MHC-Moleküle, die helfen, das Egebnis einer mykobakteri-ellen Infektion zu bestimmen).
Weltweit ~ 60 Mio. an Tbc Erkrankte * 1,7 Milliarden Infizierte (~ 1/3 der Weltbevölkerung
-> Krankheitsausbruch wird in Schach gehalten, durch Immunsystem kontrolliert
=> Schützendes Immunsystem sehr uneffektiv zur Beendigung von Infektionen, jedoch sehr effektiv bei der Prävention des Krankheitsausbruchs.
Aufgrund des labilen Gleichgewichtes zwischen M. tuberculosis und Immun-system eines infizierten Wirtes, führt jede Beeinträchtigung der schützenden Abwehr zum Fortschreiten in ein klinisches Krankheitsbild.